凍存通常是指將細(xì)胞冷凍儲存在-196℃的液氮中。如在不加任何保護(hù)劑的情況下，直接對細(xì)胞加以凍存，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)、外的水分迅速形成冰晶，進(jìn)而對細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能造成一系列的損害，如機(jī)械損傷、蛋白質(zhì)變性、電解質(zhì)升高等，最后可引起細(xì)胞死亡。為了避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，在凍存細(xì)胞時常向培養(yǎng)液中加入適量的二甲亞砜（DMSO），因其相對分子質(zhì)量較小而溶解度大，較易穿透進(jìn)入細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)冰點下降，并可提高細(xì)胞膜對水的通透性，配合以緩慢冷凍的方法，可使細(xì)胞內(nèi)的水分逐步地滲透出胞外，避免了冰晶在細(xì)胞內(nèi)大量的形成。

      復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞從-196℃的液氮中取出融解，使其活力恢復(fù)的過程?？焖偃诨氖侄慰梢员ＷC細(xì)胞外結(jié)晶在很短時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞重新結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。復(fù)蘇成功的細(xì)胞可以保持很高的活力。

細(xì)胞的凍存：

1.用0.25%胰蛋白酶溶液消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于15mL離心管中；

2.800-1000rpm離心5min，棄上清；

3.加入適量凍存液（百澳博無DMSO細(xì)胞凍存液），用吸管吹打細(xì)胞制懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106-1×107個/mL；

4.每個凍存管分裝細(xì)胞懸液1mL，旋緊凍存管的蓋；

5.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱、凍存時間、凍存人名等；

6.將凍存管置于如下條件下逐步加以凍存：-80℃，12h→液氮；

7.若使用含10%DMSO和10%FBS的培養(yǎng)液凍存細(xì)胞，則將凍存管置于如下條件下逐步加以凍存：4℃，1h→-20℃，2h→-80℃，12h→液氮。

細(xì)胞復(fù)蘇和活率測定：

1.用止血鉗從液氮罐凍存盒中取出細(xì)胞凍存管1只，迅速將其置入37℃水浴中，不斷搖動使凍存的細(xì)胞懸液盡快融化；

2.用酒精棉球擦拭凍存管，放入超凈工作臺中；

3.將已融化的細(xì)胞懸液用吸管移入離心管中，加10倍體積的RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清），吹打混勻；

4.800-1000rpm離心5min，棄上清液；

5.加入培養(yǎng)液吹打沉淀的細(xì)胞，使其懸浮，將細(xì)胞懸液與0.4%的臺盼藍(lán)溶液以9:1的比例混合。?在室溫下染色3-5分鐘，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算活細(xì)胞比例；

6.按1×105個mL的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

7.24h后取出培養(yǎng)瓶，觀察細(xì)胞生長狀況。

注意事項：

1.對數(shù)期的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，凍存后生存率較高，因此，在進(jìn)行細(xì)胞凍存時，應(yīng)盡量選擇處于此期的細(xì)胞加以凍存；

2.為了保證凍存的質(zhì)量及復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率，凍存時應(yīng)掌握好消化時間，消化過度將對細(xì)胞造成損傷，復(fù)蘇時細(xì)胞難于存活。此外，復(fù)蘇后接種時，細(xì)胞的濃度不能太低，最好控制在1×105-5×105個/mL，這樣才能保證復(fù)蘇成功；

3.凍存管的管蓋應(yīng)封蓋嚴(yán)密，以免復(fù)蘇時細(xì)胞外溢；

4.復(fù)蘇時，從液氮取出凍存管到水浴中融化的過程要快，否則將會導(dǎo)致冰晶的形成，傷害細(xì)胞。同時，一次復(fù)蘇的凍存管數(shù)量不要太多，否則會引起水浴鍋中傳熱不佳，延緩凍存的細(xì)胞懸液融化的時間；

5.為防止液氮凍傷，在復(fù)蘇過程中應(yīng)戴上棉質(zhì)手套。

細(xì)胞增殖情況：

                             24h貼壁狀態(tài)                                                                                               48h增殖情況                                                                             72h增殖情況（細(xì)胞匯合度達(dá)90%）